在一个PCR反应管中检测多个病原体核酸时，首先通过PCR反应产生大量的不同病原体的靶标序列，再针对不同病原靶标设计DNA长度和GC含量不同的荧光探针，温度较低时探针与各自靶标杂交形成特异性的双链结构，不同的双链结构有不同的解链温度，随着温度逐渐上升，双链会在各自解链温度发生解链，形成单链并同时发生荧光信号变化，该信号变化与特定病原靶标一一对应，因此可精准检出不同的病原体。利用该技术在一个荧光通道下可以检测4种以上病原体，如果采用4色荧光探针则可以检测识别出16种以上不同病原体。